免疫共沉淀（Co-IP）结果图解读（上）

最近看了不少蛋白相互作用相关的paper，出现大量的Co-IP图谱看不懂，于是小编赶紧上网学习了一波，这里跟读者们分享一下，共同进步。

首先需要说明的是，熟悉了解免疫共沉淀实验的原理及实验的操作流程是进行Co-IP结果图分析的前提。

免疫共沉淀(Co-IP)是利用抗原与抗体之间的专一性作用为基础，用于研究蛋白质与蛋白质之间相互作用的经典方法。相较于其他分子间相互作用检测方法(GST pull down 等)，免疫共沉淀实验的优势在于蛋白的结合在细胞内完成，能够反应天然状态下的蛋白质相互作用，结果更加真实可靠。

Co-IP原理

当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白 质相互作用被保留了下来，假如细胞内存在 XY 蛋白复合物，用 X(X也称为诱饵蛋白)的抗体免疫沉淀 X，那么与 X 在体内结合的蛋白质 Y(Y 也称为靶蛋白)也被沉淀下来。因此在细胞裂解液中加入 X 的抗体沉淀蛋白 X，随后利用蛋白印迹( blot，WB)检测沉淀中是否存在蛋白 Y，如果存在，则说明细胞内存 在 XY 蛋白复合物，即蛋白 XY 存在相互作用。

Co-IP流程

免疫共沉淀实验流程为:收集蛋白样品—诱饵蛋白抗体沉淀诱饵蛋白—SDS-PAGE 分离蛋白—WB 检测是否存在靶蛋白。

关键点一：沉淀诱饵蛋白

利用磁珠偶联抗体沉淀诱饵蛋白:在样品中加入磁珠偶联抗体，抗体会与诱饵蛋白结合，利用磁铁将磁珠拉下，同 时诱饵蛋白会一起被沉淀出来。如果存在与诱饵蛋白的相互作用的靶蛋白，也会被沉淀下来。如果没有诱饵蛋白的 特异性抗体，可以给诱饵蛋白加上标签(Myc、HA、Flag 等)，然后利用标签抗体沉淀蛋白。

关键点二：实验对照设置

假设 Co-IP 实验的实验组为“磁珠+抗 X 抗体+靶蛋白 X+目的蛋白 Y”，则可能出现的“假阳性”及对应需要设置 的实验对照如下表所示:

上述为了避免出现“假阳性”的对照称为阴性对照，除此之外 Co-IP 实验还会设置一个阳性对照组(Input 组)， Input 组为直接利用抗体 X(抗体 Y)对细胞裂解液进行 WB 检测，验证细胞裂解液中存在蛋白 X(抗体 Y)。在某些 Co-IP 实验中，实验人员会把 IP 后的上清分别进行蛋白 X 和蛋白 Y 的 WB 检测，该对照组称为 组。

利用内源性 Co-IP 实验为验证两个蛋白是否存在已知作用，如果最终的结果为阳性，则可以证明两个蛋白之间存在相互作用;但如果结果为阴性，无法证明两个蛋白之间不存在相互作用，也有可能是蛋白在细胞内表达量低等原因导致。因此在进行内源性 Co-IP 验证两个蛋白是否存在相互作用时，建议先做过表达 Co-IP作为对照。

在清楚知道Co-IP操作流程的前提下，弄清楚图中各个部分所代表的实验步骤，结合图中展示的结果进行分析，便可以看懂Co-IP的实验结果图。关于结果的解读免疫共沉淀，在下一次推送中我们结合文献中的4个例子再进行讲解免疫共沉淀，敬请期待！