变性凝胶电泳后测序的原理 什么是Sanger测序

常见的凝胶电泳有哪些

　　琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳

　　琼脂糖 ( Agarose ) 是一种线性多糖聚合物， 系从红色海藻产物琼脂中提取而来的。当琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固便会形成良好的 电泳介质，其密 度是由 琼脂 糖的浓 度决 定的。经过化学修饰的低熔点 (LMP) 的琼脂糖，在结构上比较脆弱 ，因此在较低的温度下便会熔化 ，可用于DNA片段的制备电泳。

　　聚丙烯酰胺凝胶主要有两种方式： 一是用于分离和纯化双链 DNA 片段的非变性聚丙烯酰胺凝胶。在未变凝胶中分离 DNA 的缺 点是 DNA 的 迁移 率受碱 基组 成和序 列的 影响。由于无法得知未知 DNA 的迁移是 否反 常，故不能用未变性的聚丙烯酰胺凝胶 电泳 确定双链 DNA的大小。二是用于分离及纯化 单链DNA 片 段的 变性聚 丙烯 酰胺凝 胶。这 类聚丙烯酰胺凝胶是在核苷酸碱基配对抑制剂 ( 尿素或甲酰胺 ) 的存在下聚合而成，变性DNA的移动速度同其碱基组成及序列几乎完全无关，故可用于分离及纯化单链DNA片段和DNA测序等。

什么是Sanger测序

Sanger法测序 利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。

直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

Sanger法测序路线

Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见的DNA碱基序列。

Sanger法测序的原理就是，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)使之扩增，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)使之终止。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3‘-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止，终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几个至千以上个，相差一个碱基一系列片断。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

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