dna测序 dna测序是检查什么

文章目录：

1. 第二代DNA测序技术的操作流程
2. 求教三种基因测序技术的原理
3. 一、二、三、四代测序技术原理详解

一、第二代DNA测序技术的操作流程

操作流程如下：

1、测序文库的构建

首先准备基因组，然后将DNA随机片段化成几百碱基或更短的小片段，并在两头加上特定的接头。如果是转录组测序，则文库的构建要相对麻烦些，RNA片段化之后需反转成cDNA，然后加上接头，或者先将RNA反转成cDNA，然后再片段化并加上接头。

2、锚定桥接

Solexa测序的反应在叫做flow cell的玻璃管中进行，flow cell又被细分成8个Lane，每个Lane的内表面有无数的被固定的单链接头。上述步骤得到的带接头的DNA 片段变性成单链后与测序通道上的接头引物结合形成桥状结构，以供后续的预扩增使用。

3、预扩增

添加未标记的dNTP 和普通Taq 酶进行固相桥式PCR 扩增，单链桥型待测片段被扩增成为双链桥型片段。通过变性，释放出互补的单链，锚定到附近的固相表面。通过不断循环，将会在Flow cell 的固相表面上获得上百万条成簇分布的双链待测片段。

4、单碱基延伸测序

在测序的flow cell中加入四种荧光标记的dNTP 、DNA聚合酶以及接头引物进行扩增，在每一个测序簇延伸互补链时，每加入一个被荧光标记的dNTP就能释放出相对应的荧光，测序仪通过捕获荧光信号，并通过计算机软件将光信号转化为测序峰，从而获得待测片段的序列信息。

5、数据分析

这一步严格来讲不能算作测序操作流程的一部分，但是只有通过这一步前面的工作才显得有意义。测序得到的原始数据是长度只有几十个碱基的序列，要通过生物信息学工具将这些短的序列组装成长的Contigs甚至是整个基因组的框架，或者把这些序列比对到已有的基因组或者相近物种基因组序列上，并进一步分析得到有生物学意义的结果。

扩展资料

第二代测序技术的核心思想是边合成边测序，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列，现有的技术平台主要包括Roche/454 FLX、Illumina/Solexa Genome Analyzer和Applied Biosystems SOLID system。

Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理是边合成边测序。在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。

参考资料：

二、求教三种基因测序技术的原理

DNA测序技术，即测定DNA序列的技术。在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。

技术1：双脱氧链末端终止法和化学降解法。

原理：

1、双脱氧链末端终止法：利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。

2、化学降解法：它通过灵敏的银染方法检测凝胶中的条带。银染提供了一种对于放射性或荧光法来说更加快速，廉价的替代方法。

技术2：单分子测序为主要特征的第三代测序技术。

三、一、二、三、四代测序技术原理详解

测序技术是基因组学的核心技术，上期的推送【 LAI：基因组组装质量评估新标准 】简单介绍了测序技术的发展进程。其实，测序技术的发展主要基于两个非常具有里程碑意义的理念： “生命是序列的”和“生命是数据的”。 序列是基因组学最基本最重要的数据，也是生命科学领域大数据时代的核心组成部分。简单来说，测序技术就是将DNA/RNA分子中碱基ATGC的排列顺序显示出来。

1953年，Watson和Crick提出DNA双螺旋结构。

DNA双螺旋模型以及“生命是序列的”观点的发表，直接推动了测序技术的发展，因为解读生命遗传信息的前提就是得到它的载体——序列。

从20世纪70年代到现在有很多测序技术和平台的产生，其中包括SBC法、454、Ion Torrent、SBL法、Sanger法、Illumina、Pacbio、Nanopore等。今天主要跟大家分享后四种常用的测序技术。

第一代测序技术

Sanger法是基于DNA合成反应的测序技术，又称为SBS法、末端终止法。1975年由Sanger提出，并于1977发表第一个完整的生物体基因组序列。

核心原理： 由于 双脱氧核苷酸(ddNTP) 的3’位置脱氧，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影，根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。

在每个反应体系中，ddNTP相对于dNTP是很少的，所以只有部分新链在不同的位置特异性终止，最终就会得到一系列长度不一的序列。

第二代测序技术

以Illumina平台为代表的第二代测序技术实现了高通量测序，有了革命性进展，使得大规模并行测序成为现实，极大推动了生命科学领域基因组学的发展。Illumina循环SBS法(cycle SBS)即SBRT(Sequencing By Reversible Termination,可逆终止)的核心技术是DNA合成的可逆性末端循环，即3'-OH可逆性的修饰和去修饰。

基本原理： 将dNTP的3'-OH以叠氮集团 RTG (Reversible Terminating Group,可逆末端基团)进行修饰；将4种碱基分别与不同的 荧光分子 连接；DNA合成时，RTG能起到类似于ddNTP的作用终止反应；每次合成反应终止并读取信号之后，洗脱RTG和荧光分子，进行下一轮循环。

主要过程：

a, DNA待测文库构建

利用超声波把待测的DNA样本打断成小片段，并在这些小片段的两端添加上不同的接头，构建出单链DNA文库。这些文库中的DNA在通过flowcell(吸附流动DNA片段的槽道)时会随机附着在flowcell表面的channel上。每个Flowcell有8个channel，每个channel的表面都附有很多接头，这些接头能和建库过程中加在DNA片段两端的接头相互配对，并能支持DNA在其表面进行桥式PCR的扩增。

b,c 桥式PCR 以Flowcell表面所固定的接头为模板，进行桥形扩增。经过不断的扩增和变性循环，最终每个DNA片段都将在各自的位置上集中成束，每一个束都含有单个DNA模板的很多份拷贝，进行这一过程的目的在于实现将碱基信号强度放大，以达到测序所需的信号要求。

测序方法采用边合成边测序的方法：

1. dNTP模型

2. dNTP加上可终止反应的基团RTG和荧光信号

3.  反应体系中同时添加DNA聚合酶、接头引物和带有碱基特异荧光标记的4种dNTP

4. 脱掉-OH和二磷酸，进行合成

5. 反应因RTG终止，激发荧光进行信号采集。

6. 洗脱RTG和荧光分子，进行下一轮循环

第三代测序技术

以Pacbio平台为代表的SMRT(Single-Molecule Real Time Sequencing,单分子实时测序)测序技术具有高通量、长读长的特点。

基本原理： Pacbio仍然采用边合成边测序的原理，但实现了两个重要的技术突破。一个是将荧光分子标记在磷酸上，这样在反应停止且捕获荧光信号以后，可直接随磷酸基团脱落，解决了因噪音污染导致的读长很短的问题；二是由于不需要PCR扩增，信号的有效提取成为了关键。通过引入零模波导孔（ZMW）技术解决这一问题。在纳米室底部有一个孔径70nm的小孔，由于远远小于激光的波长，所以激光从底部照射时，只会照亮一个小的区域，提高了信噪比。

主要过程： 如下图所示，类似于Illumina部分展示的模式图，也是边合成边测序。

第四代测序技术

纳米孔测序技术是单分子实时测序的新一代技术，主要是通过ssDNA或RNA模板分子通过纳米孔而带来的“电信号”变化推测碱基组成进行实时测序。

基本原理： 当纳米孔充满导电液时，两端加上一定电压，分子模板通过纳米孔生成可测量电流。纳米孔的直径只能容纳一个核苷酸，单链模板就会在电场作用下依次通过纳米孔而引起电流强度变化，通过检测相应的电流峰判断碱基，实现实时测序。

四大测序技术的优缺点：

Sanger法测序读长长、准确度高，但是通量不高；

Illumina测序读长短、通量高、准确度高，在进行基因组组装或者结构变异分析的时候没有优势，可用作三四代测序read的纠错；

Pacbio测序读长长、通量高、准确度不高，但可通过测序深度弥补，GC偏差低，可进行甲基化的直接测序。

Nanopore测序读长长、通量高、准确度低，不可通过测序深度弥补，但可通过Illumina read 纠错。

第一、二、三代测序技术都是基于边合成边测序的原理，因此Nanopore技术被一些人（包括我）称为第四代测序技术；

随着测序技术的发展和成熟，逐渐形成基因测序产业链

本期对于测序技术的介绍到此为止，主要是同大家交流学习，欢迎指出不足之处。另外推荐一本2016年出版的杨焕明院士的《基因组学》，非常好的一本书。

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